Mercoledì 7 Ottobre sono stati annunciati i vincitori del premio Nobel per la Chimica 2015 assegnato dall’Accademia di Svezia. Si tratta di: Tomas Lindahl; ha 77 anni e lavora all’Istituto Karolinska di Stoccolma. Attualmente è direttore emerito del gruppo di professori dell’Istituto Francis Crick e del Centro per la Ricerca sul cancro britannico presso il Clare Hall Laboratory. Dal 1978 al 1982 ha insegnato Chimica e fisiologia medica all’università di Gothenburg. Paul Modrich; ha 69 anni, è professore di Biochimica alla Duke University, School of Medicine. Ha studiato all’università di Stanford e ha lavorato allo Howard Hughes Medical Institute. Aziz Sancar; ha 69 anni, è professore di Biochimica e biofisica all’università del North Carolina. La motivazione del premio è legata al fondamentale contributo che hanno dato alla comprensione dei meccanismi di riparazione del DNA. A livello pratico i risultati delle loro ricerche hanno aperto la strada a nuove cure contro il cancro.
Il genoma umano codifica le informazioni necessarie per creare un essere umano completo. Durante ogni divisione cellulare, più di tre miliardi di coppie di basi di DNA vengono replicate e copie del genoma sono trasferite alle cellule figlie. Anche se molto efficiente, il meccanismo di replicazione del DNA commette errori. Date le dimensioni del genoma umano e del gran numero di cellule in un corpo umano gli errori inevitabilmente si accumulano durante la vita di un individuo. La maggior parte di questi errori non avranno un impatto, ma alcuni potranno anche causare malattie gravi.
Un singolo filamento di DNA è formato da una lunga sequenza di nucleotidi che si differenziano tra loro per una loro parte, denominata base azotata, che può essere di quattro tipi: adenina (A), citosina (C), guanina (G) e timina (T). Per questo si dice spesso che l’intero codice della vita è scritto con sole quattro lettere dell’alfabeto: A, C, G e T.
Nonostante il suo ruolo essenziale nel memorizzare informazioni genetiche, la molecola di DNA ha una stabilità chimica limitata ed è soggetta a decadimento spontaneo. Processi quali l’idrolisi e l’ossidazione avvengono a livelli significativi in vivo, in parte a causa di metaboliti reattivi continuamente generati in vari processi fisiologici. Inoltre, fattori esterni come radiazioni e sostanze chimiche genotossiche stimolano ulteriormente la formazione di danni al DNA. L’instabilità intrinseca del DNA costituisce sia un’opportunità sia una minaccia. Lesioni del DNA sono in grado di bloccare importanti processi cellulari come la replicazione del DNA e la trascrizione. Le lesioni possono anche essere mutagene e modificare la capacità codificante del genoma, che può portare a malattie come il cancro, malattie neurodegenerative e invecchiamento biologico. I prodotti chimici mutageni e le radiazioni possono anche avere un “effetto curativo”; possono ad esempio essere usati per trattare il cancro, introducendo lesioni del DNA per arrestare la proliferazione cellulare e stimolare la morte cellulare programmata. La cellula ha sviluppato modi per contrastare le lesioni del DNA e per mantenere le mutazioni a un livello tollerabile; un certo numero di differenti meccanismi di riparazione volti a salvaguardare l’integrità del genoma.
Fotoriattivazione – Il primo meccanismo di riparazione del DNA
Nel 1920 si è scoperto che i raggi X potevano mutare e uccidere le cellule. Successivamente, si è dimostrato che altri tipi di radiazioni come i raggi UV, influenzano la vitalità cellulare. Nel 1940, studiando i batteri e il loro recupero in risposta ai danni causati dai raggi UV è stato scoperto che la luce visibile poteva stimolare notevolmente il recupero della crescita. Il fenomeno è stato chiamato fotoriattivazione e indica l’esistenza di un meccanismo cellulare dipendente dalla luce che potrebbe correggere il danno cellulare indotto dai raggi UV. Nel 1950 è diventato chiaro che questo danno era riferito al DNA. A questo punto, Renato Dulbecco (Premio Nobel per la Fisiologia e la Medicina, 1975) ha suggerito che la fotoriattivazione era una reazione enzimatica attivata dalla luce visibile. L’osservazione di quest’ attività enzimatica, promossa dall’enzima fotolitasi ha dimostrato per la prima volta l’esistenza di enzimi di riparazione del DNA. Nel 1978 Sancar come dottorando ha cominciato a lavorare su questi aspetti. Ci sarebbero però voluti altri sei anni, prima che tornasse ad occuparsi di fotolitasi.
Riparazione al buio – La scoperta di riparazione per escissione dei nucleotidi
Oltre alla fotoriattivazione, i danni causati dai raggi UV possono anche essere riparati attraverso un processo indipendente dalla luce (riparazione al buio). Negli anni sessanta si riuscì a dimostrare che l’irradiazione con raggi UV del DNA promuove l’unione tra due residui di timina (T) sullo stesso lato della doppia elica del DNA. La luce visibile invece attiva il meccanismo molecolare che ne consente l’escissione, cioè l’eliminazione, poi denominata riparazione per escissione di nucleotidi (nucleotide excision repair, NER).
I meccanismi molecolari della NER
L’identificazione degli enzimi responsabili della NER è stata molto aiutata dall’analisi genetica e dall’identificazione e purificazione delle proteine. Oggi sappiamo che dimeri di timina sono solo uno dei numerosi tipi di lesioni che interferiscono con il normale accoppiamento delle basi che distorcere la struttura elicoidale del DNA. Tra il 1984 e il 1989, Sancar ha pubblicato una serie di articoli in cui ha descritto i meccanismi per la funzione fotolitasi. Dimostrando che la fotolitasi è in grado di convertire l’energia di un fotone assorbito producendo una reazione radicalica che innesca la scissione dei dimeri di Timina.
Il DNA è una molecola instabile
Nei primi anni 1970 Tomas Lindahl ha dimostrato che il DNA ha stabilità chimica limitata anche in assenza di aggressioni fisiche esterne. In condizioni fisiologiche il DNA è soggetto a una serie di reazioni chimiche come la deamminazione idrolitica, l’ossidazione e la metilazione non enzimatica. Queste reazioni modificano le basi del DNA e di conseguenza aumentano il rischio di mutazioni. Tomas Lindahl ha utilizzato il termine decadimento per descrivere questi processi ed ha elegantemente dimostrato che, nelle condizioni fisiologiche, a seguito d’idrolisi avviene la spontanea depurinazione del DNA che stimola la scissione delle catene di DNA. Forse la più affascinante scoperta è stata la dimostrazione di elevati livelli di deamminazione spontanea della citosina in condizioni fisiologiche, che porta alla formazione di uracile. Dal momento che l’uracile forma una coppia di basi con l’adenina, la deamminazione della citosina è un processo altamente mutageno, con importanti conseguenze a lungo termine. Alti livelli di deamminazione della citosina rappresentano un rischio di impoverendo il materiale genetico da coppie di basi citosina-guanina e la loro sostituzione con timina-adenina.
Scoperta di riparazione per escissione di basi
Sulla base della sua osservazione che l’uracile è spesso formata in-situ nel DNA, Tomas Lindahl è giunto alla conclusione che deve esistere una via enzimatica in grado di gestire questo e altri tipi di lesioni di base. In uno studio fondamentale, ha identificato la glicosilasi E. coli uracil-DNA (UNG) come la prima proteina responsabile di riparazione e due anni più tardi una seconda glicosilasi, specifica per il DNA 3-metiladenina. Sappiamo oggi che UNG è parte di una grande famiglia di proteine coinvolte nella riparazione per escissione di basi (BER). Lindahl ha dimostrato che l’enzima è specifico per il DNA. Le cellule di mammiferi contengono diversi enzimi glicosilasi che agiscono su varie forme di modifiche di base. Una volta che un nucleotide danneggiato è stato identificato, l’enzima glicosilasi si lega al DNA e promuove l’espulsione del nucleotide anomalo. La base alterata interagisce con un sito a riconoscimento specifico nella glicosilasi e viene rilasciato dalla scissione del legame. Le lesioni come queste rappresentano una sfida per i macchinari di replica, in quanto possono causare miscoding. Ad oggi, sono stati identificati più di 100 diversi tipi di lesioni ossidative e la stragrande maggioranza di queste sono corrette da BER. Le lesioni da BER corrette possono essere formate anche da fattori esogeni, comprese le radiazioni ionizzanti.
Mismatch repair
Anche per l’appaiamento errato c’è un’ apposito strumento molecolare di riparazione, il cui funzionamento è stato chiarito grazie alle ricerche di Paul Modrich, il terzo dei premiati di quest’anno. Nel 1983, Modrich dimostrò che un passaggio chiave della riparazione degli errori di appaiamento è la metilazione, cioè il legame di un gruppo metile, alle basi del DNA. Anni di studi portarono Modrich a dimostrare anche che il processo di riparazione dipende dell’ATP, la molecola che è anche fonte di energia usata in molti processi che si svolgono nella cellula e nel 1989, a ricostruire l’intero processo di riparazione in vitro, con la definizione di molte delle molecole implicate. Negli anni duemila, infine, le ricerche di Modrich si sono estese ai meccanismi di riparazione del DNA nelle cellule eucariote, con importanti risultati. Come riportato sopra, il meccanismo di replicazione del DNA non è privo di errori. C’è sempre la possibilità che un nucleotide errato venga introdotto durante la sintesi di un nuovo filamento di DNA. La divisione cellulare è tuttavia un passaggio delicato, in cui devono essere duplicate circa tre miliardi di basi; quindi qualche errore inevitabilmente si verifica. Quando gli errori portano alla mancata formazione dell’accoppiamento delle basi – A si accoppia solo con T e C solo con G – si parla di appaiamento errato.
Di conseguenza, si forma una coppia di basi non-Watson-Crick, che distorce l’elica a doppio filamento. Questi tipi di errori sono noti disallineamenti e hanno la capacità di modificare la sequenza di DNA, cioè di introdurre mutazioni. Come prima linea di difesa contro questi mismatch, si replicano DNA polimerasi che contengono un’attività 3′ o 5′ esonucleasi che permette loro di rileggere il filamento di DNA di nuova sintesi. L’attività esonucleasi può correggere errori durante la replicazione del DNA invertendo la direzione della polimerasi e ablazione dei nucleotidi erroneamente introdotti. Anche se la rilettura corregge in modo efficiente la maggior parte degli errori commessi durante la sintesi del DNA, alcune coppie di basi non-Watson-Crick ancora rimangono. Per correggere questi errori, le cellule utilizzano il mismatch repair. Si stima che tale replicazione delle DNA polimerasi con correzione tramite rilettura hanno frequenze di errore di circa 5 × 10-5, in vitro. Il mismatch repair abbassa questa frequenza e il tasso di mutazione in modo significativo, per esempio su cellule germinali umane è stimato essere vicino a 1 × 10-8 per coppia di basi e per generazione. Anche per l’appaiamento errato c’è un apposito strumento molecolare di riparazione, il cui funzionamento è stato chiarito grazie alle ricerche di Paul Modrich, il terzo dei premiati di quest’anno. Nel 1983, Modrich dimostrò che un passaggio chiave della riparazione degli errori di appaiamento è la metilazione, cioè il legame di un gruppo metile, alle basi del DNA. Anni di studi portarono Modrich a dimostrare anche che il processo di riparazione dipende dell’ATP, la molecola che è anche fonte di energia usata in molti processi che si svolgono nella cellula e nel 1989, a ricostruire l’intero processo di riparazione in vitro, con la definizione di molte delle molecole implicate. Negli anni duemila, infine, le ricerche di Modrich si sono estese ai meccanismi di riparazione del DNA nelle cellule eucariote, con importanti risultati.
