La barriera di risoluzione dei 3 Å è caduta solo nel 2015, e già due anni dopo i tre inventori della tecnica che ha rivoluzionato la determinazione della struttura 3D delle macromolecole biologiche sono stati premiati con il Premio Nobel per la Chimica 2017. “Questo metodo ha portato la biochimica in una nuova era. Una fotografia è la chiave per la comprensione. Gli avanzamenti scientifici spesso si fondano su una visualizzazione di successo di oggetti invisibili all’occhio umano”, scrive il Comitato dei Premi Nobel nelle motivazioni per l’assegnazione del premio.

Lo svizzero Jacques Dubochet , 74 anni, è attualmente è professore onorario di Biofisica nell’università di Losanna. Il tedesco Joachim Frank, 77 anni, ha a lungo insegnato Biochimica e Biofisica molecolare nella Columbia University di New York. Il britannico
Richard Henderson, 72 anni, ha sempre operato presso il Laboratorio di Biologia molecolare del Medical Research Council (Mrc) a Cambridge. I tre si divideranno in parti uguali il premio di 9 milioni di corone svedesi.

Una struttura molecolare ottenuta con criomicroscopia elettronica (credits: Reale Accademia svedese delle Scienze)

I fondamenti del metodo

La criomicroscopia elettronica (crio-EM) permette di determinare la struttura tridimensionale di molecole complesse come le proteine a livello di singola macromolecola (single particle crio-EM) e con un livello di risoluzione quasi atomica (2-3 Å). Nata alla fine degli anni ’90, le prime apparecchiature commerciali hanno iniziato a comparire a partire dal 2012-2013; da allora la crescita delle pubblicazioni è stata esponenziale. La tecnica, a differenza della cristallografia a raggi X, permette di osservare anche gli aspetti dinamici della struttura molecolare.

Il termine “risoluzione” nel campo della criomicroscopia assume un significato leggermente diverso rispetto alla cristallografia in quanto la tecnica può portare a una struttura in cui zone diverse sono state caratterizzate con un livello di risoluzione leggermente diverso. Il valore indicato, quindi, fa più giustamente riferimento a un valore mediato sull’intera struttura.

Le ricerche di Jacques Dubochet presso lo European Molecular Biology Laboratory hanno rappresentato il punto di svolta sull’applicabilità del metodo: le sottili lamine di “ghiaccio vetroso” sono ancor oggi la forma ottimale per la preparazione del campioni al fine di limitare la presenza di artefatti nelle immagini analitiche. Nel 2000 il gruppo di Joachim Franck ha pubblicato la prima struttura singola tridimensionale ottenuta con crio-EM, quella del ribosoma70S di E. coli, con risoluzione di 11,5 Å6.

La crioEM utilizza campioni di macromolecole proteiche in soluzione acquosa, in una condizione di moto disordinato: un altro vantaggio rispetto alle tecniche tradizionali, che permette di studiare approfonditamente le variazioni strutturali in tempo reale. Il “ghiaccio vitrificato” che contiene gli analiti è un materiale con caratteristiche nettamente diverse rispetto al ghiaccio cristallino. Abbiamo parlato diffusamente della tecnologia alla base della crioEM sul numero di Giugno 2016 di NCF (clicca qui per accedere alla rivista).

Le immagini sono ottenute con speciali fotocamere che possono scattare fino a 400 fotogrammi al secondo e sono poi elaborate in modo completamente automatizzato. Per ottenere una struttura con risoluzione di circa 3 Å il campione deve contenere circa 300-500 mila molecole.

In Italia la crioEM è a Milano

Il crio-micorscopio dell’Università Statale di Milano (credits: Università Statale Milano)

Il primo criomicroscopio italiano è stato installato lo scorso anno presso il Laboratorio di Crio-Microscopia elettronica (Cryo EM Lab) del Centro di ricerca Pediatrica ‘Romeo ed Enrica Invernizzi’ dell’Università di Milano. L’installazione è stata resa possibile grazie a un finanziamento di oltre 3 milioni di euro della Fondazione Invernizzi (ne abbiamo parlato sul numero di Luglio 2016 di NCF (clicca qui). Il laboratorio milanese utilizza il microscopio FEI Talos Arctica 200 kV FEG-Falcon3  (il primo in Italia) per condurre ricerche d’avanguardia sulle strutture di proteine e di complessi molecolari a fine di delucidarne i meccanismi di azione e le possibili applicazioni quali potenziali bersagli di farmaci, in particolare per la prevenzione e terapia di malattie pediatriche.

In Europa altri centri di servizio presso cui è possibile accedere alla tecnologia sono il Bio-Imaging Centre (eBIC) di Diamond, nel Regno Unito, e l’olandese Netherlands Centre for Electron Nanoscopy (NeCEN). Negli Stati Uniti tra le principali realtà del settore figurano l’infrastruttura di ricerca National Resource for Automated Molecular Microscopy (NRAMM) e il Janelia Research Campus dell’Howard Hughes Medical Institute