È passato un anno ormai dalla messa a punto dei primi Kit per la diagnosi molecolare, con tampone rino-faringeo, per la determinazione e misurazione della carica virale di SARS-CoV-2. Per approfondire l’argomento ne abbiamo parlato con il Carlo Roccio, presidente di Clonit, società italiana di biotech attiva dal 1987 nella ricerca e sviluppo di sistemi diagnostici di biologia molecolare, che ha elaborato un nuovo test molecolare che renderà possibile evidenziare le varianti di SARS-CoV-2, nel giro di un paio d’ore.

Sappiamo che la sua esperienza lavorativa l’ha vista, negli anni passati, impegnato nell’individuazione dell’antrace e successivamente nell’individuazione del virus Ebola. Può dirci qualcosa a riguardo?

Nel 2001 dopo l’attacco terroristico alle Torri gemelle, ci fu un allarme per il ritrovamento di Bacillus Antracis in buste recapitate nei centri nevralgici degli USA. Questi episodi ci stimolarono come Clonit  alla realizzazione di un kit Diagnostico basato sulla PCR (Polimerase Chain Reaction) che allora era agli albori. Scoprimmo che eravamo stati i primi al mondo… e dopo una approvazione rapida da parte di FDA li vendemmo proprio direttamente a loro! Fu il nostro primo successo, che ci portò anche ad essere inseriti nell’elenco Europeo delle Società che operano contro il Bio-Terrorismo. Nel 2014 invece, ci fu in Africa Occidentale l’outbreak di Ebola Virus, Clonit era già abbastanza conosciuta come produttrice di Kit Diagnostici di Biologia Molecolare e con l’Istituto Spallanzani ed Emergency per l’Italia entrammo nel Consorzio Europeo “Ebola MoDrad” che ricevette un finanziamento EU per la ricerca di un metodo diagnostico per il Virus Ebola effettuabile in Ospedali periferici dell’Africa. Nel giro di 12 settimane realizzammo un Kit Diagnostico in RT-PCR che provato e validato in una decina di Istituti Nazionali di Malattie Infettive Europei fu utilizzato in Sierra Leone con apparecchiature portatili.

Prima di addentrarci, nel discorso della determinazione del Virus SARS-CoV-2, possiamo fermarci e inquadrare che tipo di virus è?

I Coronavirus sono una vasta famiglia di Virus a RNA, ma solo sei (229E, NL63, OC43, HKU1,MERS, CoV, SARS-Cov) erano precedentemente noti per la capacità di infettare gli esseri umani, quindi SARS-CoV-2 è il settimo. Come altri Coronavirus, SARS-CoV-2 presenta quattro proteine strutturali, note come: Proteina S (spike), Proteina E (involucro), Proteina M (membrana) e Proteina N (nucleocapside). La Proteina N contiene il Genoma a RNA mentre le proteine S, E ed M creano insieme l’inviluppo Virale. La Proteina Spike, è quella che permette al Virus di attaccarsi alla membrana della cellula ospite.

Nel mese di marzo 2020 avete messo a punto il Kit, su base molecolare, per la determinazione del Virus SARS-CoV-2 in grado di misurare anche la  “carica virale”. Può dirci qual è il principio di funzionamento del Vostro Kit diagnostico e quali sono state le collaborazioni e con quali istituti universitari?

Con precisione abbiamo iniziato la messa a punto del kit il 7 gennaio 2020, avendo letto qualche articolo durante le vacanze di Natale su alcuni casi di polmonite interstiziale provocata da Coronavirus nella città cinese di Wuhan. Quindi, sulla base dei sequenziamenti effettuati dal CDC di Atlanta e pubblicati con relative raccomandazioni rispetto ai geni stabili sui quali disegnare le Sonde Molecolari per la RT-PCR , a inizio marzo 2020 abbiamo terminato la messa a punto interna.  Successivamente abbiamo prodotto i primi kit di valutazione e li abbiamo inviati presso l’Istituto di Malattie Infettive di UNI Milano-H Sacco (Prof Massimo Galli) e l’Istituto di Virologia di UNI Milano – Centro per le Infezioni Respiratorie (Prof E. Pariani). Avendo ottenuto esito positivo da tutte le prove effettuate, il 3 aprile 2020 è stato registrata la marcatura CE-IVD e messo in commercio in tutta l’EU.

Può dirci in cosa è diverso rispetto agli altri kit per la determinazione di Covid-19 e quali sono state le evoluzioni successive?

Innanzitutto il nostro Kit in conformità a tutta la nostra linea di prodotti per la Diagnostica delle malattie infettive è “quantitativo” in grado cioè di misurare la “Carica Virale”, dato di grande importanza per il decorso della malattia, e per misurare il follow up del Paziente. Poi, nei mesi successivi dell’estate, abbiamo iniziato la predisposizione di un nostro kit che potesse permettere una diagnosi differenziale tra la malattia Covid-19 e le forme influenzali che immaginavamo potessero presentarsi nella stagione autunno-invernale. Abbiamo così realizzato e marcato CE-IVD un Kit Multiplex RT-PCR per SarsCoV-2, Flu A e Flu B.

Capitolo varianti: dovevamo aspettarcele e quali rischi comportano?

Come è normale, SARS CoV-2 muta e si evolve a partire dal ceppo originale (chiamato Wuhan-hu-1) e con il tempo potrebbe imparare ad aggirare il nostro sistema immunitario, le cure e i vaccini. Per questo monitorarne i cambiamenti è fondamentale, ma la diffusione delle varianti ci ha fatto entrare in una fase molto delicata della pandemia. Con il passare del tempo si sono rilevate diverse mutazioni che sono state classificate con sigle e con il nome dei Paesi nei quali si sono sviluppate: UK, South Africa e Brazil. Quasi tutte le mutazioni identificate sono sul gene S, che codifica per la Proteina Spike che il virus usa per introdursi nella cellula ospite, e che costituisce il bersaglio di quasi tutti i vaccini. L’aspetto interessante è che buona parte delle mutazioni sembra indotto dal sistema immunitario umano non da errori di replicazione dell’Rna. Un ramo del nostro sistema immunitario è infatti un’arma genetica contro i virus, che introduce errori casuali nei genomi virali per neutralizzarli, ma non sempre ci riesce.

Dopo le prime settimane dalle segnalazione che nel sud dell’ Inghilterra si erano evidenziate delle varianti rispetto al genoma virale di partenza e dalla pubblicazione da parte dei centri di controllo ECDC e CDC della loro composizione nucleotidica e posizione topografica sul genoma virale, in Clonit abbiamo messo a punto la “strategia di costruzione” di un Kit che potesse evidenziare le “principali varianti conosciute” con un metodo multiplex RT-PCR, che fosse veloce, di semplice esecuzione e di basso costo rispetto al sequenziamento del genoma virale completo, per il quale servono apparecchiature costose, complicate da usare e con tempistiche di rilascio dei risultati abbastanza lungo. Abbiamo così realizzato il nostro kit Variant Catcher che, si può effettuare nei normali laboratori che già eseguono l’analisi molecolare sui tamponi, con le stesse identiche apparecchiature per l’estrazione dell’RNA dal tampone e l’amplificazione genica, e con lo stesso personale addetto in due ore circa. Dopo le prove di validazione in conformità alla normativa vigente , è stato registrato CE-IVD il 22 febbraio 2021 per l’immissione in commercio in tutta l’EU.

Un previsione per il futuro, cosa vede all’orizzonte?

Finora SARS-CoV-2 ha circolato senza ostacoli in un’ampia popolazione ospite con poca immunità, incontrando una minima resistenza o pressione selettiva. L’evoluzione osservata finora, quindi, è più una deriva genetica casuale che una forma di adattamento del virus. La comparsa delle tre varianti UK, South Africa e Brazil è la conseguenza inevitabile del tempo e dei moltissimi contagi tra individui. Il timore principale è la comparsa delle cosiddette mutazioni di fuga, che permettono al virus di aggirare il sistema immunitario o di rendere inutili farmaci e vaccini. Dovremo quindi essere bravi a intercettare i virus capaci di eludere l’immunità naturale. Forse in questo avremo un aiuto prezioso dai vaccini a RNA messaggero che potranno “in breve tempo” essere “ resettati” rispetto alle mutazioni pericolose che compariranno in futuro.

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